Собор Рождества Богородицы – центральное сооружение монастыря, начало его истории положено во времена основания обители преподобным Пафнутием. В 1444 году на месте современного собора была построена первая деревянная церковь, освященная в честь Рождества Пресвятой Богородицы, но уже через пару десятков лет, в 1460-х годах, вместо нее строится богатый белокаменный собор. Из жития преп. Пафнутия известно, что новый храм был расписан иконописцами Митрофаном и Дионисием. Собор был столь великолепен, что ему дивились даже московские князья. Просуществовал белокаменный храм чуть более ста лет.

В конце XVI века по повелению и на средства царя Федора Ивановича вместо старого белокаменного строится новый кирпичный храм. Освящен он был в 1589 году и именовался по-прежнему храмом Рождества Пресвятой Богородицы. Шлемовидное оформление пяти куполов собора придавало ему суровость, воинственность и грандиозность.  Алтарь от центральной части собора  сначала отгораживала кирпичная стена, затем вместо нее был установлен иконостас. В южной стороне алтаря за кирпичной стеной устроен придел в честь Федора Стратилата, а к северной наружной стене примыкает как самостоятельная церковь придел Великомученицы Ирины. Эти имена взяты не случайно, приделы назывались именами Небесных покровителей царя Федора и царицы Ирины, сестры Бориса Годунова. Кресты на соборе венчаются царскими коронами, что тоже не случайно – собор строился под покровительством царя. Известно, что Федор Иванович приезжал сюда на богомолье в 1592 и 1595 годах.